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Efecto de la temperatura sobre la vitalidad de las larvas L1 libres de Trichinella spiralis. Effect of temperature on the vitality of free Trichinella spiralis L1 larvae

Abstract:

The objective of this study was to determine the effect of temperatures on the

survival of first stage larvae (L1) of Trichinella spiralis. We cultured larvae from mice of strain SWISS-CD1 in concentrations of 1000, 2000 and 4000 larvae per milliliter, at two different temperatures each concentration (7ºC and 28ºC). Feasibility observations were made by direct observation every 7 days for two months. The effect of the temperature was observed in each of the conditions, observing that, at a higher concentration in cold (7ºC), the decrease in survival is more progressive and, in addition, the cultures preserved at low temperature remained viable for longer than those preserved at high temperature (28ºC). Based on the results obtained, the optimal conditions to maintain larvae of Trichinella spiralis in vitro are  cold, and in high concentrations, thus maintaining a considerable number of specimens up to 6 weeks.

Palabras clave: temperatura, concentración, parásito, triquinosis y supervivencia.

Key words: temperature, concentration, parasite, trichinosis and survival.

Introducción:

La triquinosis o triquinelosis es una patología provocada por la infestación por parásitos pertenecientes al género Trichinella. Puede cursar de forma asintomática o manifestaciones

clínicas leves, como dolor abdominal, anorexia y fiebre durante la primera semana de infección, hasta desarrollarse con graves complicaciones como consecuencia de invasiones de tejidos como el riñón, sistema nervioso central o corazón, pudiendo causar problemas nerviosos o incluso fallo cardíaco entre el décimo día y las 6 semanas tras la infección (López et al., 2001). Las manifestaciones de la enfermedad pueden persistir durante 4-6 meses. Se trata de una enfermedad cosmopolita (Murrel, 2016), distribuyéndose ampliamente en todas las latitudes y que puede tratarse con el uso de albendazol o mebendazol (García et al., 2012). La incidencia de esta parasitosis en España es baja y estable, aunque ocasionalmente se producen brotes de cierta relevancia como el de Granada en el año 2000 donde el 40% de los pacientes requirieron ingreso hospitalario, y el 87% desarrolló eosinofilia, edemas palpebrales, mialgias y fiebre (López et al., 2001).

Presentan un ciclo biológico indirecto que basa su transmisión en la depredación debido a la cual puede ser transmitida a humanos por consumo de carne cruda o poco cocinada, principalmente de cerdo o jabalí (Pasqualetti et al., 2014), parasitada con larvas infectantes de este nematodo. El periodo de incubación, que oscila entre varias horas y 51 días tras la ingesta en función del número de larvas ingeridas, determinará la gravedad de la enfermedad entre otros factores. Actualmente se reconocen 12 taxones de Trichinella en dos clados, con cápsula y sin cápsula (Korhonen et al., 2001). Tras ingerir tejido muscular del animal infectado, en las microvellosidades del intestino delgado del hospedador definitivo se produce la cópula de los adultos macho y hembra.

Posteriormente, la hembra, vivípara, libera embriones, que atraviesan las paredes intestinales, acceden al torrente sanguíneo y sistema linfático y se ubican finalmente en los músculos estriados de mayor actividad (los más oxigenados), donde invadirán los miocitos y provocarán en ellos una desdiferenciación celular hacia las denominadas “células nodriza”, células que han perdido sus características de célula muscular estriada y han adquirido una cápsula de colágeno (en las especies con cápsula) y alto grado de angiogénesis.

Las larvas permanecerán enquistadas en el tejido muscular estriado dentro de estas células, hasta que accedan, por depredación, a otro hospedador, en cuyo tracto digestivo la larva se liberará del quiste y se desarrollará hasta la forma adulta. Este parásito es considerado un logro evolutivo porque ha sido capaz de adaptarse desde millones de años atrás a todos los climas de la tierra (ártico, templado, subtropical y tropical) y también ha sido capaz de infectar tanto a animales homeotermos como poiquilotermos, ya que puede infectar a mamíferos, aves y reptiles (Korhonen et al., 2001). Las especies que infectan a mamíferos son especies encapsuladas pero las que infectan aves y reptiles son no encapsuladas.

Asimismo, las larvas presentan la capacidad de sobrevivir durante un periodo de tiempo determinado en la carne del animal infectado muerto en una situación de hipobiosis, motivo gracias al cual, el carroñerismo constituye un recurso mucho más eficaz que la depredación en el mantenimiento y expansión de Trichinella en el medio natural (Korhonen et al., 2001).

El objetivo de este estudio fue el de determinar la capacidad de las larvas L1 de Trichinella spiralis para sobrevivir tras el desenquistamiento a diferentes condiciones ambientales, como la concentración de larvas o la temperatura.

Material y métodos:

La cepa de ratones elegida para realizar el experimento fue la SWISS-CD1. Se infectaron 5 individuos de esta cepa con larvas L1 de Trichinella spiralis (genotipadas por el centro de referencia para Trichinella spp., en el ISS de Roma) por sonda oral, y fueron sacrificados 40 días después de la infección. Tras el sacrificio, se realizó una evisceración y posteriormente una digestión artificial de la canal en una disolución de pepsina 0,5% y HCl 0,7%, a una temperatura de 37ºC en agitación continua durante 1,5 horas.

Con objeto de proteger las muestras de contaminaciones ambientales que pudieran influir en el estado de las larvas (como ya se demostró en experimentos anteriores de nuestro grupo aún no publicados), se realizaron 4 lavados del precipitado de larvas con agua destilada con gentamicina y anfotericina-B. Y, por último, tres lavados más con agua destilada, sin presencia de fármacos. Una vez recogidas las larvas en una solución cristalina de agua destilada en ausencia de fármacos, se procedió a la preparación de las suspensiones madre, dosificando las larvas en 48 eppendorf a 3 concentraciones diferentes (1000, 2000 y 4000 larvas por mililitro). Cada uno de ellos por duplicado, para someterlos a dos temperaturas diferentes (7ºC y 28ºC), y todo lo anterior duplicado, para tener las muestras control y problema.

La dosificación de  los eppendorf problema se realizó añadiendo 1 mL de la suspensión madre de larvas. Las muestras fueron guardadas en una estufa de 28ºC y en una cámara fría de 7ºC (Randazzo, La Sala, & Costamagna, 2011). Se realizaron conteos del número de larvas vivas 6 días a la semana, cada 15 días, en un total de 60 días. Para el procesamiento de datos, se empleó el programa Excel con la ampliación XLSTAT. A partir de la cuarta semana se realizaron la observación de la vitalidad de las larvas mediante la prueba del azul de metileno (Randazzo y Costamagna, 2010).

Resultados:

Los resultados que hemos obtenido muestran cómo la supervivencia de larvas es mayor a la menor temperatura estudiada y dentro de esta temperatura, la máxima supervivencia se ha obtenido en la máxima concentración estudiada (p<0,001). Por un lado, en caliente, observamos que durante las primeras dos semanas la supervivencia de larvas disminuye una media de un 75% mientras que las larvas conservadas en frío presentan una caída en las primeras dos semanas de un 50%.

Después de las respectivas caídas en las supervivencias, se aprecia un enlentecimiento de la velocidad de muerte que finaliza con la senescencia del 97% de las larvas hacia la semana número 7 (Figura 1). Dentro de las larvas que se encuentran a una temperatura cálida, la máxima supervivencia se encuentra en la concentración más baja estudiada, justo al contrario de lo observado a temperaturas frías.

Existen diferencias estadísticamente significativas entre el conteo que se realizó en la semana uno, con respecto de los conteos de los días 14 y 28 (p<0,0001), pero no existen diferencias significativas entre los conteos de losdías 14 y 28 entre sí (p>0,05). Posteriormente, vuelven a aparecer diferencias significativas entre los días 28 y 42 (p<0,05), y entre los días 42 y 56 (p<0,05).

Supervivencia larvara durante 8 semanas
Tabla 1. Se observa una supervivencia más marcada a lo largo del tiempo en las larvas  que están conservadas a una temperatura  de 7ºC (FRÍO) que aquellas que están conservadas a una temperatura de 28ºC (CALIENTE). Los resultados se expresan sobre base 1 por lo que 1 indica un 100% de supervivencia larvaria.

Discusión:

Los resultados obtenidos en este trabajo se corresponden con estudios previos de nuestro grupo, aún no publicados, en los que las secuencias temporales de supervivencia larvaria se mantenían de la misma forma que la expuesta en este artículo, por lo que se trata de un resultado contundente y reproducible. Las larvas L1 de T.spiralis parecen desarrollar un estado hipobiótico cuando salen del quiste que tarda en establecerse entre 7 y 10 días, momento a partir del cual se produce una disminución de la actividad metabólica de las larvas y, por lo tanto, se produce un consumo de energía menor.

Este hecho podría explicar la presencia de una fase pre-hipobiótica en la que las larvas no están adaptadas a la vida fuera del quiste y por lo tanto se ven obligadas a desarrollar una serie de cambios en su metabolismo para evitar su muerte. Durante esta fase de adaptación, existen muchas larvas que no son capaces de adaptarse y mueren, objetivándose un 25% de dificultad mayor para la adaptación a las temperaturas altas que a las bajas.

Una vez las larvas supervivientes se han adaptado y han entrado en la fase de hipobiosis, se observa una detención en la cinética de muerte que hace que las larvas se mantengan con vida durante cuatro semanas, tiempo a partir del cual, comienzan a morir de nuevo hasta los 56 días, momento en el que se considera una muerte total de larvas.

El hecho de que se detecte un posible estado hipobiótico en las larvas fuera del quiste no ha sido previamente probado ya que lo que sí se sabe es que existe un estado de hipobiosis cuando la larva está enquistada en el tejido muscular estriado del animal (Uribarren, 2017), pero no se tiene conocimiento de la posibilidad de establecer este estado en larvas desenquistadas.

En próximos experimentos comprobaremos de forma directa si realmente existe una disminución de la actividad metabólica de las larvas entre los días 14 y 28 que las introduzca en el supuesto estado hipobiótico. Esto lo haremos repitiendo este experimento de la misma forma y cada 2 semanas se abrirá un eppendorf de cada categoría (concentración y temperatura) y se administrará glucosa  en  una  concentración de  2,77mM (A.  Castro, 1974),  realizando una determinación espectrofotométrica de la cantidad de glucosa que hay antes y después de la administración.

Si se produce una disminución de la incorporación de glucosa a la larva entre los días 14 y 28 se habrá demostrado la presencia de una disminución de la actividad metabólica de las larvas, lo cual, justificaría el estado supuesto estado de hipobiosis.

Conclusión:

Las condiciones óptimas en las que las larvas de T.spiralis son capaces de sobrevivir durante más tiempo son a una concentración elevada junto con una temperatura baja.

Las larvas que se encuentran a una temperatura cálida presentan una máxima supervivencia en concentraciones bajas.

Las temperaturas cálidas afectan más que las temperaturas frías al supuesto estado pre- hipobiótico, ya que durante el periodo en el que se establece dicho estado (7 – 10 días) se registra una mortalidad larvaria superior a 28ºC que a 7ºC.

Agradecimientos:

Agradecemos al Dr.Bolás Fernández la cesión de su laboratorio para desarrollar el estudio y también agradecemos a los miembros de la asociación Equipo de Patología Molecular de la Facultad de Farmacia su continuo trabajo en el mismo.

Bibliografía:

  1. Begoña López Hernández, M.ª Teresa Gea Velázquez de Castro, M.ª Dolores Galicia García and Jose Carlos Sabonet. 2001. Brote epidémico por Trichinella britovi en Granada durante la primavera del 2000. Revista Española de Salud Pública. 75:5. doi: 10.1590/S1135- 57272001000500007.
  • Departamento de Microbiología y Parasitología – Recursos en Parasitología. 2017.

Trichinelosis o Triquinelosis. México. http://www.facmed.unam.mx

  • 3.  Gilbert A. Castro and Shirley A. Roy. 1974. Disaccharides in the Nutrition of Trichinella spiralis. The Journal of Parasitology. 60:887-889. doi: 10.2307/3278926.
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Veterinary Parasitology. 231:92-96. doi: 10.1016/j.vetpar.2016.03.020.

  • Mariana I Pasqualetti, Marcelo Acerbo, Marcelo Miguez, Adriana Rosa, Fernando A. Fariña, Natalia Cardillo, Osvaldo J. Degregorio and Mabel Ribicich. 2014. Nuevos aportes al conocimiento de Trichinella y trichinellosis. Revista de Medicina Veterinaria. 95(2):12-21.
  • Mayra Judith García Robles, Gabriela Reveles Hernández, José Jesús Muñoz Escobedo and María Alejandra Moreno García. 2012. Utilidad del albendazol/quinfamida en el tratamiento de la fase intestinal de la infección por Trichinella spiralis en modelo murino. Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica. 31:51-61. ISSN: 0798-0264.
  • 7.  P.K. Korhonen, E. Pozio, G. La Rosa, B.C. Chang, A.V. Koehler, E.P. Hoberg, P.R. Boag,

P. Tan, A.R. Jex, A. Hofmann, P.W. Sternberg, N.D. Young and R.B. Gasser. 2016. Phylogenomic and biogeographic reconstruction of the Trichinella complex. Nature Communications. 7:10513. doi: 10.1038/ncomms10513.

  • 8.  V. R. Randazzo, and S. R. Costamagna. 2010. Methylene blue test for the determination of viability of free larvae of Trichinella spiralis. Revista Argentina de microbiología. 42:95. doi: 10.1590/S0325-75412010000200005.
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