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Efecto ex vivo de la doxiciclina sobre la vitalidad de larvas L1 de Trichinella spiralis. Ex vivo effect of doxycycline on the vitality of Trichinella spiralis L1 larvae.

Abstract:

Doxycycline is an antibiotic whose activity against Trichinella spp. organisms had never been proved. The aim of the present study was to investigate the effect of this antibiotic in an ex vivo culture of Trichinella spiralis first state’s larvae (L1). Larvae from SWISS-CD1 rats were cultured in three different concentrations (1000, 2000 and 4000 larvae per milliliter) and two different temperatures (7ºC and 28ºC) ant larvae vitality was evaluated through direct examination each 15 days for two months. Doxycycline affected vitality in all conditions, but its effect was faster in cultures with higher larvae concentration compared with its effects in lower concentration cultures. Also, the effect was faster in lower temperature than that observed in higher temperatures. Thus, doxyxycline could show activity against Trichinella spiralis L1 larvae vitality in an ex vivo culture.

Palabras clave: doxiciclina, parásito, triquinosis y supervivencia.

Keywords: doxycycline, parasite, trichinosis and survival.

Introducción:

La triquinosis o triquinelosis es una patología provocada por la infestación por nematodos parásitos pertenecientes al género Trichinella. Puede cursar de forma asintomática o manifestaciones clínicas leves, como dolor abdominal, anorexia y fiebre, durante la primera semana de infección, hasta desarrollarse con graves complicaciones como consecuencia de invasiones de tejidos como el riñón, el sistema nervioso central o el corazón, pudiendo causar problemas nerviosos o incluso fallo cardíaco entre el décimo día y las 6 semanas tras la infección. Las manifestaciones de la enfermedad pueden persistir durante 4-6 meses. Se trata de una patología cosmopolita, distribuyéndose ampliamente en todas las latitudes y que puede tratarse con el uso de albendazol o mebendazol.

La incidencia de esta parasitosis en España es baja y estable, aunque ocasionalmente se producen brotes de cierta relevancia como el de Granada en el año 2000 donde el 40% de los pacientes requirieron ingreso hospitalario, y el 87% desarrolló eosinofilia, edemas palpebrales, mialgias y fiebre. Presentan un ciclo biológico indirecto que basa su transmisión en la depredación debido a la cual puede ser transmitida a humanos por consumo de carne cruda o poco cocinada, principalmente de cerdo o jabalí, parasitada con larvas infectantes de este nematodo.

El periodo de incubación, que oscila entre varias horas y 51 días tras la ingesta en función del número de larvas ingeridas, determinará la gravedad de la enfermedad entre otros factores. Actualmente se reconocen 12 taxones de Trichinella agrupados en dos clados, con cápsula y sin cápsula (Korhonen et al., 2001). Tras ingerir tejido muscular del animal infectado, en las microvellosidades del intestino delgado del hospedador definitivo se produce la cópula de los adultos macho y hembra.

Posteriormente, la hembra, vivípara, libera embriones, que atraviesan las paredes intestinales, acceden al torrente sanguíneo y sistema linfático y se ubican finalmente en los músculos estriados de mayor actividad (los más oxigenados), donde invadirán los miocitos y provocarán en ellos una desdiferenciación celular hacia las denominadas “células nodriza”, células que han perdido sus características de célula muscular estriada y han adquirido una cápsula de colágeno (en las especies con cápsula) y alto grado de angiogénesis.

Las larvas permanecerán enquistadas en el tejido muscular estriado dentro de estas células, hasta que accedan, por depredación, a otro hospedador, en cuyo tracto digestivo la larva se liberará del quiste y se desarrollará hasta la forma adulta. Este parásito es considerado un logro evolutivo porque ha sido capaz de adaptarse desde millones de años atrás a todos los climas de la tierra (ártico, templado, subtropical y tropical) y también ha sido capaz de infectar tanto a animales homeotermos como poiquilotermos, ya que puede infectar a mamíferos, aves y reptiles (Korhonen et al., 2001).

Las especies que infectan a mamíferos son especies encapsuladas, pero las que infectan aves y reptiles son especies no encapsuladas. Asimismo, las larvas presentan la capacidad de sobrevivir durante un periodo de tiempo determinado en la carne del animal infectado muerto en una situación de hipobiosis, motivo gracias al cual, el carroñerismo constituye un recurso mucho más eficaz que la depredación en el mantenimiento y expansión de Trichinella en el medio natural (Korhonen et al., 2001).

El objetivo de este estudio fue el de explorar, de forma indirecta, la posibilidad de la presencia de microorganismos simbiontes del género Wolbachia debido a que, en estudios previos de nuestro grupo, aún no publicados, demostramos que el antibiótico estreptomicina presentaba un leve efecto antiparasitario (p=0,037) al intentar usarlo como agente preventivo de contaminaciones bacterianas en los cultivos ex vivo.

Material y métodos:

Se emplearon 5 ratones de la cepa SWISS-CD1 que fueron sacrificados 40 días después de la infección con larvas L1 de Trichinella spiralis (genotipadas por el centro de referencia para Trichinella spp. ISS de Roma) por sonda oral. Después del sacrificio, se realizó una evisceración con una posterior digestión artificial de dichas vísceras en una disolución de pepsina 0,5% y HCl 0,7%, a una temperatura de 37ºC en agitación continua durante 1,5 horas. Posteriormente, se realizaron 4 lavados del precipitado de larvas con agua destilada que presentaba gentamicina y anfotericina B como agentes protectores de contaminaciones ambientales que no influyesen en el estado de las larvas (como ya se demostró en experimentos anteriores de nuestro grupo aún no publicados), y unquinto lavado con agua destilada sin fármacos.

Una vez las larvas se encontraron en una disolución cristalina de agua destilada sin los agentes antimicrobianos, se dosificaron en 48 eppendorfs a 3 concentraciones diferentes (1000, 2000 y 4000 larvas por mililitro), cada uno por duplicado para dos temperaturas diferentes (7ºC y 28ºC) y todo lo anterior duplicado para tener las muestras control y problema. Este proceso se repitió en 4 ocasiones para realizar una observación cada 15 días de cada muestra (60 días).

La dosificación de los eppendorfs problema se realizó añadiendo 0,5mL de la suspensión madre de larvas con 0,5mL de una disolución de doxiciclina inicial de 200μg/mL, quedando una suspensión de larvas en cada eppendorf problema de 100μg/mL de doxiciclina y con concentraciones diferentes de larvas en función de los requerimientos de la muestra. En el caso de los eppendorfs control, se depositó 1ml de la suspensión de larvas sin antibióticos. Las muestras fueron guardadas en una estufa de 28ºC y en una cámara fría de 7ºC. Para el procesamiento de datos, se empleó el programa Excel con la ampliación XLSTAT. A partir de la cuarta semana, la valoración de la vitalidad se valoró a través de la técnica del azul de metileno (Randas y Costamagna, 2010).

Resultados:

Efecto ex vivo de la doxiciclina sobre larvas a lo largo de 8 semanas
Gráfica 1. Se observa la comparación de la supervivencia larvaria a lo largo de 56 días comparando las larvas que estaban en presencia de doxiciclina con sus controles a diferentes concentraciones y dos temperaturas (7ºC – FRÍO y 28ºC – CALIENTE).

Los resultados que hemos obtenido muestran cómo, en primer lugar, la supervivencia de las larvas es mayor a 7ºC que a 28ºC (p<0.001). En cuanto al efecto de la doxiciclina, se puede comprobar que, en el primer recuento, la supervivencia fue menor únicamente en las muestras conservadas en frío a las dos concentraciones más elevadas (p<0.05), mientras que, en el segundo, la diferencia se observó en todos los grupos de experimentación (p<0.05). En el tercer conteo, únicamente se encuentran diferencias entre los grupos correspondientes a las muestras conservadas en caliente con una concentración de 2000 larvas/mL (p<0.005). Finalmente, en el último recuento no se observan diferencias estadísticamente significativas en ninguno de los grupos comparados.

Se puede apreciar  como la fase de potencial hipobiosis  se  establece entre los días  14 y  28  de experimentación de la misma forma que indican estudios previos de nuestro grupo aún no publicados. En las larvas que han sido tratadas con doxiciclina se observa una caída del 90% justo antes de establecerse el periodo hipobiótico, mientras que las larvas control presentan una caída del 50%. La salida del estado hipobiótico y la entrada en la fase de senescencia comienza a partir del día 30 en todos los grupos de experimentación (a excepción de las larvas a 28ºC y concentración de 2000larvas/mL que entran en fase de senescencia a partir del día 24), objetivándose una mortalidad del 98% en el día 56 del experimento.

Discusión:

Los resultados obtenidos en este trabajo sobre la vitalidad de las larvas en función de la temperatura se corresponden con los obtenidos en estudios previos de nuestro grupo aún no publicados, los cuales indican que la máxima supervivencia se consigue a concentraciones altas de larvas (4000larvas/mL) y temperaturas bajas (de entre 5ºC y 7ºC). Este hecho puede tener una importante repercusión en futuras investigaciones porque podría suponer una aproximación a un protocolo de cultivo estándar. Ciertos antibióticos presentan actividad frente a parásitos eucariotas, con dos posibles vías de actuación: (1) es posible que los antibióticos que actúen uniéndose a los ribosomas bacterianos puedan presentar actividad frente a los ribosomas mitocondriales de eucariotas, que presentan cierta similitud estructural con éstos.

Por otra parte, (2) en el caso de las filarias, los antibióticos actúan frente a una bacteria simbionte del parásito, imprescindible para su viabilidad en términos reproductivos (Bentum y Boateng, 2015). Estudios previos de nuestro grupo demostraron que los antibióticos penicilina, estreptomicina, gentamicina y anfotericina no mostraron una actividad significativa sobre la vitalidad de las  larvas L1 de Trichinella spiralis (experimento que surgió para justificar el por qué habían muerto todas las larvas de T. spiralis en tan poco tiempo al emplear una serie de antibióticos a la vez como preservantes de contaminación, lo que parece descartar la posibilidad de sensibilidad intrínseca de las mitocondrias del parásito a los antibióticos que actúan a nivel ribosomal (Moullan et al., 2016).

Las tetraciclinas han demostrado tener actividad frente a especies del género Plasmodium (Gaillard et al., 2015) afectando a la funcionalidad de los ribosomas mitocondriales, a la síntesis de novo de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, y a la expresión génica. Además, el tratamiento con tetraciclinas ha mostrado tener actividad sobre la expresión génica en especies de los géneros Trypanosoma (Hashimi et al., 2016) y Leishmania (Kraeva et al. 2014).

Las bacterias simbiontes descritas en helmintos que sirven como diana farmacológica en el tratamiento de la filiariasis pertenecen al género Wolbachia (y han demostrado ser resistentes a la acción de numerosos antibióticos, siendo generalmente sensibles, específicamente, a los antibióticos del grupo de las tetraciclinas. De hecho, la doxiciclina se ha incorporado al arsenal terapéutico usado en el tratamiento de las filariasis, consiguiendo una reducción en la carga parasitaria, con acción tanto microfilaricida como macrofilaricida (Bentum y Boateng, 2015). Por otra parte, existen estudios sobre la actividad de la doxiciclina en el desarrollo de otros nematodos. Concretamente, una exposición a doxiciclina ha demostrado incrementar la longevidad y movilidad en diferentes estados de C.elegans.

Nuestros resultados indican que en los momentos iniciales y finales del estudio no hay diferencias significativas en la vitalidad de las larvas expuestas a antibiótico y las larvas del grupo blanco, encontrándose las diferencias únicamente en los periodos intermedios. Este hecho podría justificarse dado que la duración del experimento ha sido suficiente como para provocar la muerte de todas las larvas en ambos grupos, y el efecto del antibiótico habría sido el de acelerar este proceso.

Sin embargo, a pesar de haber quedado demostrada la actividad de la doxiciclina sobre la vitalidad de las larvas L1 de Trichinella spiralis, es necesario plantear experimentos posteriores para profundizar en el mecanismo de acción en el que se basa dicha actividad, puesto que el comportamiento de esta especie frente al antibiótico se asemeja más al de los nematodos que presentan bacterias simbiontes que al del resto de nematodos, pero no ha sido descrita la presencia de bacterias simbiontes en esta especie. En el caso de Brugia malagy se ha descrito que su secuencia de genes codificantes es bastante similar en tamaño a los de Trichinella spp. por lo que podría tratarse de una aproximación a la posibilidad de que existan simbiontes del género Wolbachia también en Trichinella spp.

Conclusiones:

La doxiciclina afecta negativamente a la supervivencia de las larvas acelerando la llegada de la fase de senescencia en el caso de las larvas que se encuentran a 28ºC y 2000larvas/ml (las cuales son las que peor supervivencia presentan también en el control) y dificultando la entrada a la fase hipobiótica en un 40%. Siendo la doxiciclina un fármaco selectivo frente a bacterias del género Wolbachia no podemos rechazar la hipótesis de que puedan existir estos simbiontes en el interior de Trichinella spiralis, y, además, sabemos que el genoma de un tipo de filaria es similar al de Trichinella spp. por lo que podría existir, además, algún parentesco evolutivo.

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