• Boston

Trichinella spiralis: Evaluación del efecto de diferentes antibióticos sobre larvas L1 libres.

ABSTRACT

The objective of the present study was to evaluate the individual activity of the antibiotics penicillin G, streptomycin, gentamicin and amphotericin B on the vitality of the L1 larvae of Trichinella spiralis in an ex vivo culture in order to verify its toxicity on the nematode. In previous studies by our group, the use of all of them together (to avoid contamination) resulted in a notable reduction of the larvae’s survival. To do this, the larvae from SWISS-CD1 mice were cultured at a concentration of 2000 larvae/mL and a temperature of 7ºC, divided into four experimental groups, corresponding to the four antibiotics, and a control group. The vitality of the larvae was determined by direct examination at seven-day intervals for two months, supplemented with methylene blue staining (Randazzo and Costamagna, 2010). There was only a slight antiparasitic effect with streptommycin (p=0,037). The others antibiotics showed no significant differences with the control group (p>0,05). Therefore, it was concluded that the antibiotics penicillin G, gentamicin and amphotericin B have no activity, individually, against the vitality of the L1 larvae of T. spiralis in an ex vivo culture.

PALABRAS CLAVE

Parásito, Trichinella, supervivencia, antibióticos, toxicidad.

KEY WORDS

Parasite, Trichinella, survival, antibiotics, toxicity.

INTRODUCCIÓN

Trichinella spiralis es un nematodo parásito, agente etiológico de la triquinelosis. Se trata de una enfermedad cosmopolita (Murrel, 2016), distribuida ampliamente en todas las latitudes y que puede tratarse con el uso de bencimidazoles carbamatos como el albendazol o mebendazol, los cuales son altamente eficaces frente a todas las fases de la infección, aunque su eficacia disminuye en las fases crónicas de la enfermedad cuando los quistes musculares se vuelven más maduros (García et al, 2012). A pesar de todo, se sigue buscando una manera más eficaz de tratar la triquinelosis, como combinar albendazol con quinfamida, lo cual no dio resultado (Redalyc, 2011-2012) o emplear el efecto citoprotector de dos inmunógenos de T. spiralis (Scielo, 2007). La incidencia de esta parasitosis en España es baja y estable, aunque ocasionalmente se producen brotes de cierta relevancia como el de Granada en el año 2000, donde el 40% de los pacientes requirieron ingreso hospitalario, y el 87% desarrolló eosinofilia, edemas palpebrales, mialgias y fiebre (López et al., 2001).

Actualmente se reconocen 12 taxones de Trichinella con distribución cosmopolita en las diferentes áreas zoogeográficas (árticas, templadas, subtropicales y tropicales), agrupados en dos clados, con cápsula y sin cápsula (Korhonen et al., 2001), siendo encapsuladas las especies que infectan a mamíferos y no encapsuladas las que infectan a aves y reptiles. Esta adaptación es la responsable de la capacidad de las larvas para sobrevivir en la carroña por largos periodos de tiempo en hipobiosis. Esto hace que el carroñerismo sea mucho más eficaz que la depredación en la transmisión de Trichinella spp.

Presentan un ciclo biológico autoheteroxeno que basa su transmisión al ser humano por consumo de carne cruda o poco cocinada, principalmente de cerdo o jabalí (Pasqualetti et al., 2014), parasitada con larvas infectantes de este nematodo. El periodo de incubación, que oscila entre varias horas y 51 días tras la ingesta, en función del número de larvas ingeridas, determinará la gravedad de la enfermedad, entre otros factores. Tras ingerir tejido muscular del animal infectado y gracias a la acción de los jugos y enzimas gástricas las larvas quedan libres de la cápsula e invaden la mucosa del intestino delgado donde se desarrollan hasta el estado adulto. Posteriormente, se produce la cópula entre machos y hembras; tras la cual, la hembra, vivípara, libera embriones, que atraviesan las paredes intestinales, acceden al torrente sanguíneo y sistema linfático y se ubican finalmente en los músculos estriados de mayor actividad. Allí, invadirán los miocitos, provocando en ellos una desdiferenciación hacia nuevas entidades denominadas “células nodriza”, células que han perdido sus características de célula muscular estriada y han adquirido una cápsula de colágeno (en las especies con cápsula) y alto grado de angiogénesis. Las larvas permanecerán en este nuevo nicho, hasta que accedan, por carnivorismo (depredación o carroñerismo), a otro hospedador, en cuyo tracto digestivo la larva se liberará del quiste y se desarrollará hasta la forma adulta. El carácter zoonótico de esta parasitosis, ligado a su transmisión basada en el carnivorismo, exige un exhaustivo control de la carne de consumo. En el caso de detectarse un positivo en un matadero, se sigue el plan de contingencia nacional frente a Trichinella spp. que incluye la destrucción de la carne infestada (Becerril, 2011) con el correspondiente perjuicio económico para la industria porcina.

El objetivo principal de este estudio fue determinar la capacidad de las larvas L1 de T. spiralis para sobrevivir en presencia de ciertos antibióticos de forma individual. En estudios previos de nuestro grupo, el uso de estos 4 antibióticos en combinación, usados con el fin de prevenir la

contaminación bacteriana y fúngica a lo largo de la incubación y las manipulaciones inherentes a las observaciones, redujo drásticamente la vitalidad de las larvas en un periodo de tiempo muy corto. Este experimento pretendía resolver si este efecto era consecuencia de una acción tóxica por sobredosis o a una acción nematocida de los antibióticos per se.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se emplearon 5 ratones de la cepa SWISS-CD1 que fueron sacrificados 40 días después de su infección con larvas L1 de Trichinella spiralis (genotipadas por el centro de referencia para Trichinella spp. en el ISS de Roma) por sonda oral. Después del sacrificio, se realizó una evisceración con una posterior digestión artificial de dichas vísceras en una disolución de pepsina 0,5% y HCl 0,7%, a una temperatura de 37ºC en agitación continua durante 1,5 horas. Posteriormente, se lavaron las larvas 4 veces con agua destilada antes de proceder a su dosificación. Se dosificaron 40 eppendorfs a una concentración de 2000 larvas/ml. Los eppendorfs se dividieron en cinco grupos de experimentación, que se correspondieron con los tratamientos con penicilina G, estreptomicina, gentamicina y anfotericina B, y al grupo control. Las concentraciones de los antibióticos fueron de: 0,1 mg/ml de penicilina G, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 0,15 mg/ml de gentamicina y 0,05 mg/ml de anfotericina

  • Todos los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 7ºC (Randazzo, La Sala, & Costamagna, 2011). La vitalidad de las larvas se determinó en intervalos de una semana, mediante el examen directo de muestras de cada grupo. Para el procesamiento de datos, se empleó el programa Excel con la ampliación XLSTAT. A partir de la cuarta semana se realizaron la observación de la vitalidad de las larvas mediante la prueba del azul de metileno (Randazzo y Costamagna, 2010).

RESULTADOS

Los resultados que hemos obtenido muestran cómo la supervivencia de las larvas expuestas a antibióticos no difiere significativamente de la supervivencia de las larvas control (p>0,05), excepto en el caso de la estreptomicina (p=0,037). La vitalidad de las larvas disminuye de forma constante hasta la 4ª semana, donde se alcanza una vitalidad del 30%. A partir de este punto, la mortalidad se ralentiza hasta llegar a un 90% de senescencia en la 8ª semana. La estreptomicina provoca mayores caídas de la vitalidad en las semanas 3 y 7.

DISCUSIÓN

Tras los ensayos realizados con distintos antibióticos (gentamicina, penicilina, estreptomicina y anfotericina B) sobre las larvas L1, y atendiendo a los datos estadísticos, podemos comprobar que su influencia no produce diferencias significativas con respecto a los resultados obtenidos en ausencia de antibiótico, excepto en el caso de la estreptomicina, que muestra un ligero efecto antiparasitario, aunque no resultó estadísticamente significativo. La causa de esta toxicidad podría evaluarse en futuros experimentos.

Además, en ensayos previos aún no publicados de nuestro grupo, se comprobó que el uso conjunto de todos los fármacos citados sobre las larvas L1 de Trichinella spiralis fue tóxico. Por ello, nuestros futuros ensayos se encaminarán a conocer si esta toxicidad fue debida a una concentración tóxica o a un efecto sinérgico del cocktail empleado.El sinergismo ya ha sido descrito entre distintos

antibióticos, como son las penicilinas y estreptomicinas, 2 de los antibióticos que han sido objeto de nuestro estudio, lo que nos hace pensar que quizás podría ser la causa de la toxicidad del cocktail. De cualquier forma, es necesario un futuro ensayo para esclarecer la causa de dicha toxicidad.

Por otro lado, también será necesario realizar un estudio del efecto de distintas combinaciones de estos fármacos a diversas concentraciones sobre las larvas L1 de T. spiralis con el fin de encontrar la combinación a la que no se produzca toxicidad, al tiempo que se previene la proliferación de todos los posibles microorganismos contaminantes, sin afectar, por supuesto, a la vitalidad de las larvas objeto de estudio. Se conseguiría así establecer un protocolo de cultivo ex vivo estandarizado para las larvas L1 de T. spiralis que garantice su vitalidad y/o viabilidad en ausencia de contaminaciones.

CONCLUSIÓN

Los antibióticos penicilina G, gentamicina, estreptomicina y anfotericina B han demostrado no poseer actividad frente a la vitalidad de las larvas L1 libres de Trichinella spiralis en un cultivo ex vivo. Por otro lado, el antibiótico estreptomicina tiene un ligero efecto antihelmíntico y, por lo tanto, no debería ser usado en cultivos ex vivo de larvas L1 de T.spiralis.

Dichos antibióticos por separado no afectan a la vitalidad de larvas, pero no podemos garantizar que eviten la contaminación ya que cada uno por separado no es capaz de actuar sobre todos los grupos de microorganismos que pueden causar contaminación. Por lo que, no se puede emplear un único tipo de antibiótico para mantener el cultivo durante mayor tiempo viable.

Dado el distinto espectro de acción de los 4 antibióticos es necesario realizar nuevos ensayos para encontrar la combinación de concentraciones óptima en un cocktail que garantice la ausencia de microorganismos contaminantes en un cultivo de larvas L1 de T. spiralis, sin afectar a la vitalidad de las mismas.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Dr. Bolás Fernández la cesión de su laboratorio para desarrollar el estudio y también agradecemos a los miembros de la asociación Equipo de Patología Molecular de la Facultad de Farmacia su continuo trabajo en el mismo.

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