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Fundamentos de la técnica patch-clamp. Basics of the patch-clamp technique.

El patch-clamp es una técnica electrofisiológica empleada en el estudio de las propiedades eléctricas, tanto pasivas como activas, de las células. Basada en la generación de un sello de alta resistencia entre el electrodo de registro y la membrana celular, ésta técnica posibilita el registro de corrientes a través de canales iónicos expresados en la misma, lo cual ha permitido caracterizar los canales expresados en diversos tipos celulares y profundizar en sus características biofísicas. El objetivo de este trabajo es el de conocer en profundidad la técnica patch-clamp y aplicarla para el registro de corrientes de potasio en células musculares lisas vasculares (CMLV) aisladas. Para ello, se ha realizado una revisión bibliográfica en PubMed (descriptores: “patch clamp technique”, “isolated vascular smooth muscle cells”) y en los fondos bibliográficos del departamento. Además, se ha llevado a cabo el aislamiento enzimático y el registro de corrientes iónicas expresadas en CMLV de la arteria mesentérica de la rata. En el presente trabajo se exponen los principios teóricos de la técnica de patch clamp, en su configuración de célula entera (“whole cell”) y se ofrece un resumen de los procesos que se han llevado a cabo para realizar los registros en CMLV aisladas. Además, hemos registrado corrientes voltaje-dependientes de salida a través de canales de K+ en las CMLV que median la dilatación del músculo liso en la arteria mesentérica de la rata.

La membrana celular, por su capacidad de separar y acumular cargas eléctricas de signo contrario a cada uno de sus lados, presenta un comportamiento capacitativo. A su vez, la actividad de los canales iónicos que se encuentran embebidos en ella y que permiten el paso de iones, confieren a la membrana un componente resistivo/conductivo. La capacitancia y la conductividad son las llamadas características eléctricas pasivas, que tienen un papel esencial en la regulación de la actividad celular (Kornreich, 2007). La técnica de patch clamp, basada en la formación de un sello de alta resistencia entre el electrodo y la membrana celular, nos permite estudiar estas características y registrar corrientes a través de los canales iónicos expresados en ella. Existen distintos tipos de canales en función de los iones a los que permiten el paso. En el presente trabajo, hemos podido registrar, mediante la técnica de patch-clamp, los canales de K+ en el músculo liso vascular de arteria mesentérica de la rata, que se relacionan con la dilatación de los vasos. En estas células se han descrito canales de K+ activados por calcio (KCa) de alta conductancia (BKCa) y canales de K+ activados por voltaje (Kv). También hay canales de K + rectificadores de entrada (KIR), que contribuyen a mantener el potencial de membrana (por tanto, el tono vascular) de las células musculares lisas vasculares (CMLVs) (Ko et al., 2008). La activación de los canales Kv se debe a una diferencia de potencial que le llegue a la célula, mientras que los canales BKCa también son sensibles al aumento de la concentración intracelular de Ca2+. En ambos casos la activación de dichos canales genera la hiperpolarización del tejido muscular liso, que se traduce en una relajación de la CMLV (Ko et al., 2008).

Material y métodos: Para la realización de los experimentos se usaron ratas Wistar macho. Tras su sacrificio, se les extrajo el intestino junto con la vasculatura mesentérica, la cual se depositó en una placa de Petri con solución salina fisiológica (PSS) (composición en mM: NaCl 119; KCl 4,6; MgCl2 1,2; NaHCO3 24,9; KH2PO4 1,2; CaCl2 1,5; glucosa 11; EDTA 0,027) Las ramas de segundo orden de la arteria mesentérica fueron disecadas, abiertas longitudinalmente y sumergidas en una solución con albúmina sérica bovina (BSA) de 1mg/ml (en PSS, 0mg/ml de Ca2+, sin EGTA). Las arterias se mantuvieron en nevera durante 10 minutos y tras este tiempo se llevaron a un baño de agua con una temperatura de 37ºC, donde se dejaron equilibrar por 10 minutos. Tras el periodo de equilibrado, las arterias se pasaron a una solución de papaína (0,5mg/mL) durante 8 minutos y posteriormente, tras dos lavados en una solución 0mg/ml de Ca2+ nominal sin EDTA, se llevaron a una solución de colagenasa tipo H (0,4mg/mL) y tipo F (0,7mg/mL) durante 3 minutos. Tras la digestión enzimática, las arterias se pasaron a una solución PSS fría y se procedió a la dispersión de las células musculares por medio del uso de una pipeta Pasteur de punta pulida. Una vez realizada la dispersión se sembró la muestra líquida (con las células en suspensión) en un pocillo y tras 15-20 minutos, que permitió que las células se adhiriesen al fondo del pocillo, se cambió la solución PSS por la solución extracelular de composición (en mM): 130 NaCl; 5 KCl; 1,2 MgCl2; 1,5 CaCl2; 10 glucosa; 10 HEPES (ajustadas a pH 7,3 con NaOH). Los microelectrodos de registro se prepararon a partir de capilares de borosilicato utilizando un estirador, se pulieron las puntas usando una microforja, presentando una resistencia final de entre 3 y 4MΩ. Los microelectrodos se llenaron con una solución intracelular rica en K+ (composición en mM: 130 KCl, 1.2 MgCl2, 0.1 EGTA y 10 HEPES (ajustadas a pH 7.2 con KOH). El acercamiento del microelectrodo a la célula se llevó a cabo con la ayuda de un micromanipulador piezoeléctrico. Se utilizó la técnica de patch-clamp en la configuración de “célula entera” fijándose el voltaje de membrana en -65mV y se registraron corrientes en respuesta a rampas de voltaje hiper- y despolarizantes y de -100 a 160mV de amplitud y 600ms de duración. La ventaja de realizar esta técnica en las CMLVs obtenidas frescas es que evita la necesidad de usar cultivos celulares en los que la expresión de canales de membrana puede cambiar respecto a una situación fisiológica.

Resultados: Mediante la técnica de patch-clamp hemos registrado corrientes de potasio (K+ ) en CMLVs aisladas. En la primera imagen se puede observar la morfología clásica de una CMLV (Figura 1A), objeto de estudio en este trabajo, mientras que la segunda imagen está tomada con el microelectrodo de registro en contacto con la misma (Figura 1B). En el momento en el que el microelectrodo tocó la membrana celular, la resistencia, calculada por medio de la aplicación continua de un pulso de 10mV (Figura 1C izquierda), aumentó hasta que se generó un gigasello, cuando el orden de magnitud aumentó de MΩ a GΩ, indicando que la membrana se encontraba introducida parcialmente en la punta del microelectrodo (Figura 1C centro). Una vez obtenido el gigasello y por medio de una presión negativa ejercida sobre la célula a través del micoelectrodo, se produjo la ruptura de la membrana celular, lo cual hace que entren en contacto la solución de dentro del microelectrodo con el interior de la célula, apareciendo corrientes transitorias de capacidad (Figura 1C derecha). Esto permite el registro de las corrientes generadas en la totalidad de la célula (configuración de célula entera). Al aplicar una rampa de voltaje hiper- y despolarizante, se obtuvo una corriente de potasio con rectificación de salida (Figura 1D). La morfología de esta corriente de salida es la clásica de los canales BKCa, que permiten el paso de una gran cantidad de iones K+ como respuesta la variación de potencial que estamos aplicando a la célula. Además, podemos suponer también la activación de canales Kv, aunque es difícilmente apreciable al estar enmascarada por la enorme respuesta que generan los canales BKCa. La salida de iones de K+ a través de estos canales, produce una hiperpolarización que fisiológicamente se relaciona con la relajación del músculo liso a través de la cual se regularía el tono vascular, produciéndose en este caso una vasodilatación. Figura 1: CMLV obtenida tras el proceso de digestión enzimática (A). Microelectrodo de registro formando un gigasello con una CMLV aislada (B). Corrientes generadas en respuesta a pulsos de 10mV y 100 Hz durante el proceso de formación del sello de alta resistencia (C). Corriente de salida en respuesta a una rampa de -100 a 160mV registrada en CMLV aislada fijando el Vm a -65mV (D).

Figura 1: CMLV obtenida tras el proceso de digestión enzimática (A). Microelectrodo de registro formando un gigasello con una CMLV aislada (B). Corrientes generadas en respuesta a pulsos de 10mV y 100 Hz durante el proceso de formación del sello de alta resistencia (C). Corriente de salida en respuesta a una rampa de -100 a 160mV registrada en CMLV aislada fijando el Vm a -65mV (D).




Discusión: Los canales BKCa localizados en CMLVs están formados por una subunidad alfa formadora del poro y una subunidad beta reguladora. La subunidad beta es muy importante debido a que es la que indica el grado de sensibilidad al calcio que presenta este canal, motivo por el cual, no se expresan la misma subunidad beta en todos los tejidos en los que se expresa el canal BKCa (Wang et al., 2006). En las células que hemos estudiado la subunidad prevalente es la β1, la cual se encuentra codificada por el gen hKCNMB1. La sensibilidad al calcio de la subunidad beta 1 puede reducirse en procesos patológicos como la hipoxia, causando una menor activación del canal y por lo tanto una mayor vasoconstricción (Liu et al., 2018). Los canales de potasio sensibles a voltaje son tetrámeros que están ampliamente distribuidos por todo el organismo, pero a nivel del tejido muscular liso vascular se expresan las isoformas 1.1, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6 y 2.1 aunque este último está menos extendido (Jackson, 2006). En algunos vasos sanguíneos se ha descrito la presencia de canales de la familia 7.1, 7.4 y 7.5 (Nelson et al., 1990). Existen una serie de moléculas que pueden activar estos canales induciendo vasodilatación, como es el caso de óxido nítrico (NO), el ácido sulfhídrico, que actúa sobre todo a nivel de la aorta (Cheang et al., 2010), o el peróxido de hidrógeno, que actúa principalmente a nivel de las arterias coronarias y mesentéricas (Roggers et al., 2006). También estos canales son sensibles a la hipoxia y a la acidosis, de tal manera que causan vasodilatación en dichas condiciones (Hedegaard et al., 2013).

Conclusión: La técnica de patch-clamp en su configuración de “célula entera”, por medio de la formación de un sello de alta resistencia entre el microelectrodo y la membrana celular, es una técnica adecuada para el estudio de la totalidad de las corrientes iónicas de entrada o salida generadas en una célula. Hemos conseguido registrar corrientes de potasio en CMLVs aisladas frescas, que fisiológicamente se corresponderían con respuestas de relajación en los vasos, participando en la regulación del tono vascular. Las CMLVs expresan canales BKCa, sensibles a las variaciones en el voltaje y en la concentración intracelular de calcio y canales Kv, sensibles únicamente a la variación de voltaje.

D.Gómez, D. Fajardo, J. Coca, I de los Santos. J Physiol Biochem (2018) 74 (Suppl 1):S1-S99 doi: 10.1007/s13105-018-0656-7

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